Diverzitet populacije Pseudomonas syringae pv. syringae poreklom sa različitih biljnih domaćina

Abstract

Fitopatogena bakterija Pseudomonas syringae pv. syringae parazitira oko 180 biljnih vrsta, među kojima najveći ekonomski značaj ima na voćnim vrstama, zatim ratarsko-povrtarskim, ali i na nekom ukrasnom bilju. Kod nas je eksperimentalno potvrđena kao parazit kruške, jabuke, kajsije, trešnje, višnje, šljive, maline, breskve, tikve, blitve i graška. Razvojem molekularnih metoda omogućeno je praćenje genetičkog diverziteta populacije ove bakterije poreklom sa različitih domaćina, kao i otkrivanje veza između patogenih varijeteta unutar same vrste P. syringae. Obzirom da je bakterija P. s. pv. syringae izuzetno polifagna i da je utvrđena na velikom broju domaćina kod nas, cilj ovog rada je bio proučavanje populacije ove bakterije poreklom za različitih domaćina analizom sekvenci konzervativnih gena (MLSA). Izolati korišćeni u radu su poreklom sa trešnje (KBNS91 i V-109), višnje (V-85 i V-88), graška (Gr1), blitve (Ps105) i tikve (7/1). Kao referentni korišćen je soj P. s. pv. syringae GSPB 1142 poreklom sa pasulja. Bakterijska suspenzija gustine 107-108 ćel/ml je pripremana u tubicama sa sterilnom vodom u koju su dodavane pojedinačne kolonije izolata gajenih na hranljivom agaru, starosti 48 sati. Zatim je vršena ekstrakcija DNK korišćenjem CTAB metoda. Za analizu sekvence korišćeni su produkti dobijeni amplifikacijom konzervativnih gena gltA, gapA, gyrB i rpoD. Umnožavanje DNK je vršeno prema sledećem protokolu: inicijalna denaturacija 95°C 3 min; denaturacija 94°C 2 min, hibridizacija 56°C 1 min, elongacija 72°C 1 min (35 ciklusa); finalna elongacija 72°C 5 min. Sekvenciranje dobijenih PCR produkata je vršeno u Macrogen Inc. Neighbour-joining filogenetsko stablo je konstruisano korišćenjem Mega7 programa. Filogenetsko stablo konstruisano na bazi sekvenci konzervativnih gena ukazuje na razdvajanje izolata u dva klastera. Jednu grupu čine izolati sa trešnje (V-109) i višnje (V-88), dok drugu grupu čine ostali izolati koji ispoljavaju razlike unutar same grupe. Tako, sličnost su pokazali izolati sa višnje (V-85), graška (Gr1) i tikve (7/1), dok su sličnost sa referentnim sojem sa pasulja (GSPB 1142) pokazali izolati sa trešnje (KBNS91) i blitve (Ps105). Dobijeni rezultati ukazuju na postojanje genetičkog diverziteta populacije P. s. pv. syringae, koji nije uslovljen poreklom domaćina sa koga je bakterija izolovana, obzirom da su razlike utvrđene i unutar istog domaćina. Rezultati takođe pokazuju da je analiza svakog od korišćenih gena ukazala na postojanje razlika u populaciji, pa stoga upotreba samo dva gena može biti diskriminatorna u slučaju proučavanja genetičke heterogenosti sojeva bakterije P. s. pv. syringae.